布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白DK63—887基因缺失株的构建及鉴定

摘要：为了构建羊布鲁菌16M（简称16M）的DK63—887基因缺失株（16MADK63—887），探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法，以卡那基因替换DK63—887基因，获得突变株16MADK63—887。将亲本株16M、疫苗株M5—90、突变株16MADK63—887在相同条件下振荡培养，观察其生长趋势变化；将各菌株置于不同外界环境中，观察其生存率；将各菌株侵染小鼠巨噬细胞，比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT—qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63—887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比，16MADK63—887在体外培养生长趋势与亲本株相似，只是细菌的浓度存在一定差异；突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株；侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降；RT—qPCR检测到突变株的ULKI、Beclinl表达量均显著降低（P〈0．01），结果表明，布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关，为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。