柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

摘要：为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列（EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT）及Sanger的部分EST序列（Contig1218）设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×10^7个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×10^4 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列（EtSAG2、EtMIC-2）,并成功获得EtMCAT和EST序列（Contig1218）的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶（Cathepsin B）。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。