H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT—PCR检测方法的建立

摘要：根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列，通过Blast进行比对，在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物，引物扩增的片段大小分别为569bp和424bp，应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法，对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析，以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明，所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569bp的片段，参试的禽肺病毒毒株扩增出424bp的片段，没有其他条带出现，而对照的参试毒株在569bp和424bp处没有任何条带；敏感性试验结果表明，本试验建立的方法能检测到10pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测，H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份，禽肺病毒阳性的样品2份；随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析，经比对分析，2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒（No．JF715045．1）100％同源，2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株（No．AF187154）100％同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT—PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点，可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。