水貂IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

作者: 王洋 [1] ; 胡博 [1] ; 张海玲 [1] ; 鲁荣光 [1] ; 吕爽 [1] ; 刘昊 [1] ; 孙彦刚 [1] ; 马凡舒 [1] ; 赵建军 [1] ; 张蕾 [1] ; 薛向红 [1] ; 史宁 [1] ; 白雪 [1] ; 徐淑娟 [1] ; 范思宁 [2] ; 凌明玉 [2] ; 李欣彤 [1] ; 闫喜军 [1]

关键词: SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR 水貂 α干扰素 β干扰素 γ干扰素

摘要：为采用SYBR GreenⅠ染料建立检测水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的MiIFN-α和MiIFN-β、MiIFN-γ和3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因序列,分别设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增MiIFN-α、MiIFN-β、MiIFN-γ和MiGAPDH的基因片段,构建到pMD18-T载体中制备质粒标准品,建立了相应基因mRNA的荧光定量RT-PCR检测方法并建立标准曲线。结果表明,MiGAPDH、MiIFN-α和MiIFN-β和MiIFN-γ基因的Ct值与标准品稀释度在10拷贝质粒/μL~107拷贝质粒/μL内均呈良好的线性关系,相关系数（R2）均为1.00,熔解曲线均呈单一熔解峰,检测下限为10拷贝质粒/μL,重复性试验表明组内、组间变异系数均小于4.5%。临床样品检测结果表明水貂感染肠炎病毒后,MiIFN-α、MiIFN-β和MiIFNγ相对表达水平均在6d达到最高峰值,MiIFN-α相对表达量要比MiIFN-β和MiIFN-γ相对表达量高两个数量级,并且在感染期（4d~6d）MiIFN-α相对表达量明显提高。本研究为水貂IFN mRNA的定量分析提供了有效工具。

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