山羊痘病毒SYBRGreen I实时定量PCR检测方法的建立

摘要：为了建立一种灵敏、特异、快速的山羊痘病毒实时定量检测方法，根据山羊痘病毒（AY077835）gp006基因序列，应用BeaconDesigner7．7软件设计合成一对PCR引物。将被检测的目的DNA片段克隆PEASY-T1质粒，制备重组质粒标准品，以期建立以质粒拷贝数为单位的标准曲线。通过反应条件的优化及引物浓度的筛选，建立了山羊痘病毒SYBRGreenI实时定量PCR（real-timePCR）检测方法，最佳引物浓度为400nmol／L。组内重复试验和组间重复试验变异系数均低于2％，最低检测限为1×10^1copies／μL，上机检测时间在1h以内。用该方法对2011年流行于云南华坪、景谷及2003年流行于云南宣威、寻甸和昆明的山羊痘临床组织样品进行定量检测，结果送检组织样品抽提DNA中病毒含量分别为1．03×10^5、5．30×10^3、1．51×10^4、4．74×10^3、7．20×10^4copies／μL。结果表明，所建立的real-timePCR具有灵敏、特异、快速的特点，适合于山羊痘临床组织样品的定量检测。